MENGENAL HEMASITOMETER DAN CARA PENGGUNAANNYA

MAKALAH

MENGENAL HEMASITOMETER DAN CARA PENGGUNAANNYA

PENGENDALIAN ORGANISME PENGGANGGU TANAMAN

OLEH :

FAHRIZAL NOOR

MENTERI PERTANIAN

BADAN PENGEMBANGAN SUMBER DAYA MANUSIA PERTANIAAN

SEKOLAH TINGGI PENYULUHAN PERTANIAN (STPP) MAGELANG

JURUSAN PENYULUHAN PERTANIAN DI YOGYAKARTA

TAHUN 2014

MENGENAL HEMASITOMETER DAN CARA PENGGUNAANNYA

PENGENDALIAN ORGANISME PENGGANGGU TANAMAN

                                                                                                                                                I.            PENDAHULUAN

1.1       Latar Belakang

Hemasitometer

Hemasitometer adalah suatu alat yang dapat digunakan untuk melakukan perhitungan sel secara cepat dan dapat digunakan untuk konsentrasi sel yang rendah Hemasitometer pada mulanya diperuntukkan untuk menghitung sel darah, yang ditemukan oleh Louis-Charles Malassez.Bentuknya terdiri dari 2 counting chamber dan tiap chamber-nya memiliki garis-garis mikroskopis pada permukaan kaca. Luas total dari chamber adalah 9 mm2.Chamber tersebut nantinya akan ditutup dengan coverslip dengan ketinggian 0.1 mm di atas chamber floor.

Perhitungan sel

Penghitungan konsentrasi sel pada hemasitometer ini bergantung pada volume dibawah coverslip.Pada chamber terdapat 9 kotak besar berukuran 1 mm2 dan kotak-kotak kecil, di mana satu kotak besar sama dengan 25 kotak kecil sehingga satu kotak besar tersebut memiliki volume sebesar 0.0001 ml. Adapaun kotak yang paling kecil berfungsi untuk mempermudah perhitungan sel.

Kelebihan

Kelebihan perhitungan sel dengan menggunakan hemasitometer adalah dapat menghitung jumlah sel yang hidup maupun yang mati, tergantung dari pewarna yang digunakan. Misalnya, bila pewarna trypan blue dicampukan ke dalam larutan sel maka sel yang hidup tidak akan berwarna dan sel yang mati akan berwarna biru.^[1] Kelebihan lainnya adalah morfologi sel dapat diamati, dapat mengevaluasi homogenitas dan data mendeteksi kontaminasi.

1.2       Rumusan Masalah

Dengan melihat latar belakang yang dikemukakan sebelumnya maka masalah yang akan dirumuskan dalam makalah ini adalah bagaimana menggunakan Hemasitometer

1.3       Tujuan Penulisan

Adapun tujuan dari penulisan ini dibuat adalah untuk mengetahui bagaimana Hemasitometer

1.4       Kajian Pustaka

            Haemocytometer : Berupa slide kaca tebal berbentuk empat persegi panjang. Pada bagian tengahnya terdapat kotak sebanyak 400 buah. Yakni terdiri dari 25 kotak besar. 1 kotak besar terdiri dari 16 kotak kecil sehingga berjumlah 400 kotak. Alat ini sangat akurat untuk menghitung kepadatan plankton yang ada dengan meletakkan gelas penutup diatasnya, maka dapat diketahui kedalaman kotak yakni 0,1 mm, panjang 1 mm dan lebar 1 mm. (alat ini juga sering dipakai dalam ilmu kedokteran yaitu untuk menghitung jumlah eritrosit pada sel darah merah). Yang hemocytometer diciptakan oleh Louis-Charles Malassez dan terdiri dari tebal kaca mikroskop slide dengan lekukan persegi panjang yang menciptakan ruang. Ruangan ini diukir dengan menggunakan laser-tergores grid dari garis tegak lurus. Perangkat ini disusun dengan hati-hati sehingga daerah yang dibatasi oleh garis yang diketahui, dan kedalaman ruang juga dikenal. Oleh karena itu mungkin untuk menghitung jumlah sel-sel atau partikel dalam volume tertentu cairan, dan dengan demikian menghitung konsentrasi dalam cairan sel-sel secara keseluruhan.

                                                                                                                         II.            HASIL DAN PEMBAHASAN

Contoh penggunaan Hemasitometer

Ada beberapa contoh penggunaan Hemasitometer diantaranya yaitu

1.      Pemghitungan sel darah

Prinsip :          
Darah diencerkan dalam pipet thoma leukosit dengan menggunakan larutan pengencer Turk ( Acetid Acid 2 %, Hidrocloric Acid 1%), kemudian dimasukkan kedalam kamar hitung. Jumlah sel leukosit dihitung dalam volume tertentu, dengan menggunakan faktor konversi jumlah sel leukosit / mikroliter darah dapat diperhitungkan.         

Alat dan Bahan :        
Hemocytometer, yang terdiri dari pipet thoma leukosit, kamar hitung, aspirator.
Mikroskop
Deck glass      
larutan pengencer turk, hidrocloric acid 1%  

Cara Kerja :    
1. Desinfeksi jari yang akan  ditusuk dengan alkohol 70%, lakukan pengambilan darah.    
2. Hisap darah kedalam pipet thoma leukosit sampai tanda 0,5 %    
3. Hapus darah yang melekat pada sebelah luar pipet.          
4. Masukkan ujung pipet kedalam larutan Turk sambil menahan darah pada garis tanda tadi, pipet dipegang dengan membentuk sudut 45 derajat. kemudian isap larutan turk perlahan sampai tanda 11, hati hati jangan sampai ada gelembung udara.       
5. Angkat pipet dan cairan, tutup ujung pipet dengan ujung jari, lalu lepaskan aspirator.    
6. Kocok pipet 15-30 detik. Jika tidak segera digunakan letakkan mendatar.          
7. Siapkan kamar hitung.       
8. Kocok pipet tadi agar homogen +- 3 menit, kemudian buang cairan 3-4 tetes.    
9. Segera teteskan setetes saja pada kamar hitung, jangan sampai banjir menggenangi parit.           
10. Biarkan mengendap +- 2-3 menit.           
11. Hitung jumlah leukosit dalam 4 kotak besar dengan perbesaran 100 X. 


Pembahasan :
Hitung leukosit merupakan menyatakan jumlah sel leukosit perliter darah (System International Units = SI unit) atau per satu mmk darah. Jumlah leukosit memiliki nilai normal 4000 - 11000 / mmk. Berikut ini adalah cara hitung lekosit dengan cara manual menggunkan Bilik Hitung.

 Perhitungan :

dikopi dari www.sodiycxacun.web.id

Keterangan : N = Jumlah sel yang ditemukan

V = Volume bilik hitung

P = Pengenceran

 Pemeriksaan laboratorium untuk menetap jumlah sel darah putih dalam bahan pemeriksaan darah, yang bertujuan untuk Menegakkan diagnosis dan Pemantauan penyakit / pengobatan

dikopi dari www.sodiycxacun.web.id

Reagen yang diperlukan larutan TURK berisi :

• Asam Acetat glacial 2,5% 15 ml

• Gentian Violet 1 ml

• Aquades 475 ml

Sebenarnya terdapat 2 cara yang digunakan dalam hitung jumlah leukosit yaitu cara automatic menggunakan mesin penghitung sel darah ( hematologic analyzer ) dan juga cara manual menggunakan pipet leukosit, kamar hitung dan mikroskkop.

Cara automatic lebih unggul, karena tekhniknya mudah, waktu yang dibutuhkan sangat singkat tidak seperti cara manual yang membutuhkan waktu yang lama, kesalahannyapun juga sangat kecil +- 2 %

2.      GELAS OBJEK KAMAR HITUNG

Daerah yang diperintah dari hemocytometer terdiri dari beberapa, besar, 1 x 1 mm (1 mm ²⁾ kuadrat. Ini dibagi dalam 3 cara; 0,25 x 0,25 mm (0,0625 mm ^2), 0,25 x 0,20 mm (0,05 mm ²⁾ dan 0,20 x 0,20 mm (0,04 mm ² ). Pusat, 0,20 x 0,20 mm ditandai, 1 x 1 mm persegi dibagi lagi menjadi 0,05 x 0,05 mm (0,0025 mm ²⁾ kuadrat. Yang mengangkat tepi hemocytometer memegang coverslip 0,1 mm dari grid ditandai. Ini memberikan setiap persegi volume yang ditetapkan.

Dimensi	Area	Volume pada kedalaman 0,1 mm
1 x 1 mm	1 mm 2	100 nl
0,25 x 0,25 mm	0,0625 mm 2	6,25 nl
0,25 x 0,20 mm	0,05 mm 2	5 nl
0,20 x 0,20 mm	0,04 mm 2	4 nl
0,05 x 0,05 mm	0,0025 mm 2	0,25 nl

Ukuran sel-struktur yang akan dihitung adalah yang terletak di antara tengah-tengah tiga baris di bagian atas dan kanan atas kuadrat dan batin dari tiga baris di bagian bawah dan kiri alun-alun.

Dalam peningkatan Neubauer hemocytometer (menengah umum), jumlah sel per ml dapat ditemukan hanya dengan mengalikan jumlah total sel ditemukan dalam kotak hemocytometer (daerah sama dengan kotak merah pada gambar di sebelah kanan) oleh 10 ⁴ (10000 ).

Berikut adalah dua metode sederhana untuk menghitung sel berdasarkan luas permukaan hemacytometer digunakan untuk menentukan jumlah sel. Other counting schemes are accetable also.  The choice of methods depends upon the cell concentration – the accuracy of the procedure depends upon the number of cells counted.  When cell concentration is low, one should count more grids. Lain skema accetable menghitung juga. Pemilihan metode tergantung pada konsentrasi sel – ketepatan prosedur tergantung pada jumlah sel dihitung. Ketika sel konsentrasi rendah, orang harus menghitung lebih grid.

Metode A      
Menghitung jumlah sel-sel di luar kotak 4 (lihat panel sebelah kiri Gambar 2).

Konsentrasi sel dihitung sebagai berikut:

Sel konsentrasi per mililiter = Total jumlah sel dalam 4 kuadrat x 2500 x faktor pengenceran

Contoh: Jika salah satu sel 450 dihitung setelah menipiskan suatu alikuot suspensi sel 1:10, konsentrasi sel asli = 450 x 2500 x 10 = 11.250.000 / ml

Metode B       
Perkiraan sel 5 konsentrasi dengan menghitung kuadrat di tengah alun-alun besar (lihat panel sebelah kanan pada Gambar 2).

Konsentrasi sel dihitung sebagai berikut:

Sel konsentrasi per mililiter = Total jumlah sel dalam 5 kuadrat x 50.000 x faktor pengenceran

Contoh: Jika salah satu sel setelah 45 dihitung menipiskan suatu alikuot suspensi sel 1:10, konsentrasi sel asli = 45 x 50.000 x 10 = 22.500.000 / ml

PIPET THOMMA

Pipet Thomma adalah jenis pipet yang digunakan untuk pengenceran sel darah. Ia tidak mengukur menipiskan darah atau cairan dalam jumlah tertentu (misalnya, dalam mililiter), melainkan dalam hal bagian dari volume total volume pipet. Yang pipet terdiri dari sebuah batang yang ditandai dengan 2 divisi. Tanda pertama menunjukkan unit 0,5, dan yang kedua menunjukkan tanda 1,0 unit. Di atas batang adalah bola lampu pencampuran yang berisi manik-manik kecil.  Alat ini membantu dalam pencampuran darah dan pengencer. Lampu di atas pencampuran kapiler pendek lain dengan tanda berukir (11,0 di sel putih pipet dan 101,0 pada sel merah pipet). Sel merah pipet volume 101 unit. Batang setiap pipet berisi 1 unit volume dan bola lampu berisi bagian sisanya.

Perhitungan sel darah dengan menggunakan hemasitometer, di dapat sebagai berikut :

1. Perhitungan sel darah merah (sdm) :

sdm 1 : 54

sdm 2 : 69

sdm 3 : 77

sdm 4 : 65

sdm 5 : 78

∑ sdm : 343

Rata-rata (x): ∑ sdm = 68,8

6

Sel darah merah  = x × factor pengali

= 68,6 × 50.000

= 3.430.000 sel per ml darah

1. Perhitungan sel darah putih (sdp) :

sdp 1 : 115

sdp 2 : 120

sdp 3 : 135

sdp 4 : 127

∑ sdp : 497

Rata-rata (x) : ∑ sdp = 124,5

4

Sel darah putih = x × factor pengali

= 124,5 × 3200

= 397600 sel per ml darah

Prosedur Praktikum

1.  Menghitung Sel Darah Merah

Terlebih dahulu isap darah merah sampai batas strip 0,5 menggunakan pipet  batu merah, setelah itu isap larutan hayem sampai batas 101 lalu kocoklah larutan tersebut menurut angka 8 selama 5 menit setelah selesai biarkan larutan tersebut selama 10 menit, ambil kamar hitung bunker lengkap dengan cover glassnya, teteskan 3 tetes ke tisu, dan teteskan 1 tetes pada burker diatas cover glass. Amati di bawah mikroskop lalu  gambarkan dan buat kesimpulan.

2.  Menghitung Sel Darah Putih

  Isap darah putih sampai batas strip 0,5 menggunakan pipet tetes batu putih, setelah itu isap larutan turk sampai batas 11 lalu kocoklah larutan tersebut menurut angka 8 selama 5 menit setelah selesai biarkan larutan tersebut selama 10 menit, ambil kamar hitung barker lengkap dengan cover galassnya, teteskan 3 tetes ke tisu, dan teteskan 1 tetes pada burker di atas cover glass, amati di bawah mikroskop lalu  gambarkan dan buat kesimpulan.

Untuk Perhitungan Sel Darah Merah (Erytrosit) diperoleh :

             n = 287

Jumlah sel darah merah (N)   = n x 10⁴

= 287 x 10⁴

= 2.870.000  sel/mm³

Untuk Perhitungan Sel Darah Putih (Leukosit) diperoleh :

            n =  163

Jumlah sel darah putih   = n x 4 x 500

= 163 x 4 x 500

                                                     = 326.000 sel/mm³

4.2.       Pembahasan

Sel darah merah paling banyak jumlahnya. Sel-sel darah merah mempunyai bentuk cakra, dengan diameter 7,5 µm dan ketebalan di tepi 2 µm. Tengah-tengah dari cakra tersebut lebih tipis (1 µm) dari pada tepinya. Bentuk “bikonkaf” yang menarik ini mempercepat pertukaran gas-gas antar sel-sel dan plasma darah.

Sel darah merah (eritrosit)  pada darah ikan lebih banyak daripada sel darah putih (leukosit), ini dapat dilihat dari hasil praktikym yang di dapat hasil sel darh merah sebanyak 240500 sel darh merah sedangkan sel darah putih (leukosit) adalah 2340 sel darah putih. Manfaat daari banyaknya sel darh merah ini adalah sebagai penyalur makanan di dalam tubuh dan pengedar oksigen di dalam tubuh.

Komponen utama dari darah yaitu sel-sel darah dan plasma darah. Sel-sel darah  terbagi lagi menjadi sel darah merah (eritrosit), sel darah putih (leukosit) dan sel pembeku darah atau bitir-butir darah (trombosit).

Eritrosit (sel darah merah) pada ikan berinti, bewarna merah kekuningan. Eritrosit dewasa berbentuk lonjong, kecil dan berdiameter 7-36 mikron (bergantung kepada spesies ikannya) jumlah eritrosit tiap-tiap mm³ darah berkisar antara 20.000-3.000.000. pengangkutan oksigen dalam darah bergantung kepada jumlah hemoglobin (pigmen pernapasan) yang terdapat didalam eritrosit Tim ikhtiologi (2010).

Leukosit (sel darah putih) yang tidak bewarna berjumlah antara 20.000-150.000 dalam tiap-tiap mm³ darah. Leukosit dapat dibedakan menjadi dua yaitu granulosit dan agranula.

Banyak cara yang dapat dilakukan untuk mengetahui jumlah jasad  renik di dalam suatu suspensi atau bahan. Cara-cara tersebut dibedakan menjadi beberapa kelompok, yaitu:

1. Perhitungan jumlah sel
1. Hitungan mikroskopis
2. Hitungan cawan
3. MPN (Most Probable Number)
2. Perhitungan massa sel secara langsung

1. Volumetric
2. Gravimetric
3. Kekeruhan (turbidimeter)
2. Perhitungan massa sel secara tak langsung

1. Analisis komponen sel (protein, DNA, ATP)
2. Analisis produk katabolisme (metabolit primer, metabolit sekunder, panas)
3. Analisis konsumsi nutrien (karbon, nitrogen, oksigen, asam amino, mineral).

praktikum ini dilakukan dengan cara, yaitu ragi (yeast) pada suspensi ragi dihitung. Pertama, haemocytometer  disediakan dan dibersihkan agar steril dengan alkohol. Sebagai alat bantu mengamati banyaknya mikroba, mikroskop disediakan. Haemocytometer  diletakkan di atas meja objek mikroskop. Peletakan ini jangan sampai terbalik. Selanjutnya, kamar utama pada haemocytometer   dicari yang berada di tengah haemocytometer. Kamar utama terdiri dari kotak-kotak kecil dan kotak kecil itu dicari. Kamar yang kecil telah didapatkan, lalu cover glass dipasang di atas haemocytometer.  Suspensi ragi dituangkan pada haemocytometer. Aliran suspensi akan bergerak dan dibiarkan beberapa saat agar memenuhi permukaan haemocytometer. Kemudian mikroba yang terdapadat pada kamar kecil dihitung jumlah bakteri yang ada dalam kotak. Penghitungan ini dengan cara penghitungan diagonal kanan atau kiri. Koloni counter digunakan dalam penghitungan mikroba.

Data dan hasil pengamatan

Tabel 1 perhitungan mikroba secara langsung dengan metode diagonal

60				60
	72		71
		87
	63		65
65				58

Contoh perhitungan

Jumlah sel mikroba(diagonal kanan)= ∑ rata-rata mikroba diagonal × 25 × × 10³

                                                              = × 25 × × 10³

                                                              =1,71 × 10⁷ sel/mL

Jumlah sel mikroba(diagonal kiri)= ∑ rata-rata mikroba diagonal × 25 × × 10³

                                                              = × 25 × × 10³

                                                              =1,73 × 10⁷ sel/mL

Hasil praktikum memperoleh bahwa jumlah mikroba dalam suspensi ragi ini sebesar karena diperoleh dalam diagonal kanan ialah 1,71 × 10⁷ sel/mL dengan jumlah mikroba pada setiap kotak 60, 72, 87, 65, dan 58. Sedangkan pada diagonal kiri mikroba terhitung 65, 63, 87, 71, dan60 ; sehingga jumlah mikroba menjadi 1,73 × 10⁷ sel/mL. Hasil ini berbeda mungkin dikarnakan saat penghitungan tidak teliti.

Berdasarkan hasil praktikum ini menperoleh bahwa jumlah bakteri dari metode penghitungan diagonal kanan sebesar 1,71 × 10⁷ sel/mL dan pada diagonal kiri sebesar 1,73 × 10⁷ sel/mL.

                                                                                                                                              III.            KESIMPULAN

            Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari austu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Praktikum ini menggunakan perhitungan secara langsung. Penghitungan koloni secara langsung, dilakukan agar mengetahui secara langsung juga. Penghitungan ini dikatakan tidak akurat jumlah mikroba yang di dalam sampel, karena hanya berdasarkan pada mikroba yang ada. Mikroba yang ada pada media ataupun sampel yang terhitung tidak hanya mikroba  yang hidup, mungkin saja mikroba yang mati juga terhitung.

            Hasil penghitungan ini menggukan Hauser Chamber atau Haemocytometer. Alat ini memiliki ruang atau kamar-kamar yaang nantinya Ruang hitung terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,2 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel nakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui.

            Hal yang harus dilakukan pada perhitungan mikroba secara langsung ini dengan membersihkan terlebih dahulu Petroff-Houser Chamber atau Haemocytometer dengan alkohol 70%. Tujuan  pembersihan ini dilakukan agar steril (tidak ada mikroba yang lain berada pada alat ini). pembersihan juga dengan mengelap dengan tissue dan usahakan tidak ada goresan pada alat ini karena akan terkihat saat melihat di mikroskop. Setelah proses pembersihan alat ini, cover glass diletakkan di atas Haemocytometer. Peletakkan ini beguna dalam menjaga mikroba yang akan dihitung pada ruang alat tetap bentuknya dan tidak terkontaminasi. Kemudian suspensi ragi dituangkan dengan mikro pipet dengan jumlah tertentu. Suspensi ini akan bergerak mengalir ke permukaan alat dan akan mengisi ruang alat ini. Ruang yang terisi dengan mikroba pada yang terletak pada ruang atau kotak kecil dapat langsung dihitung dengan metode digonal kanan ataupun diagonal kiri. Hasil perhitungan dirata-rata kemudian hasil rataan dimasukkan rumus untuk kotak sedang. Perhitungan juga harus memperhatikan faktor pengenceran, jika dilakukan pengenceran maka jumlah sel/ml dikalikan faktor pengenceran. Jumlah yang dihasilkan pada diagonal keduanya akan sama atau tidak jauh berbed (Dwidjoseputro 1990).

           

Daftar pustaka

Wikipedia bahasa Indonesia, ensiklopedia bebas

http://tentang19kita.blogspot.com/2012/12/hitung-jumlah-leukosit-metode-pipet_23.html

Hitung Jumlah Leukosit Metode Pipet

http://dhamadharma.wordpress.com/2010/02/11/laporan-akhir-praktikum-menghitung-sel-darah-merah-dan-sel-darah-putih-pada-ikan-lele-clarias-gariepinus/